猴痘病毒（MPXV）的檢測方法

猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）與天花、牛痘屬于正痘病毒屬（Orthopoxvirus genus）。1970年9月1日，在剛果民主共和國（當(dāng)時稱為剛果共和國）的巴桑庫蘇醫(yī)院首次發(fā)現(xiàn)了人類MPXV病例。猴痘病毒主要由嚙齒、靈長類等野生動物傳播給人，并在人際間有限的傳播，引起一種罕見的病毒性人畜共患病——猴痘。猴痘臨床癥狀與天花相似，但癥狀較輕。猴痘早前主要發(fā)生在中非和西非靠近熱帶雨林的偏遠地區(qū)，隨著對人類的適應(yīng)MPXV逐漸演化為：中非（剛果盆地）和西非兩個進化枝，其中剛果盆地分支毒性和傳播能力更強。

猴痘病毒介紹

猴痘病毒是一種有包膜的雙鏈DNA病毒，對宿主細胞DNA和RNA復(fù)制的依賴程度很低，可在宿主細胞質(zhì)中復(fù)制。與同屬病毒相似，MPXV很可能在宿主細胞質(zhì)中復(fù)制形態(tài)獨特的胞內(nèi)成熟病毒（IMV）和胞外包膜病毒（EEV）。IMV具有堅固的物理結(jié)構(gòu)，便于在宿主之間傳播，而更脆弱的EEV被包膜包裹，限制宿主免疫清除，因此適合病毒在細胞間傳播。MPXV能有效地感染人原代單核細胞，通過抑制CD4+和CD8+ T細胞活化，消除局部T細胞反應(yīng)，避免全身免疫抑制及免疫監(jiān)測。

猴痘病毒臨床診斷

猴痘的最佳診斷樣本來自皮膚病變——囊泡和膿皰液體，以及干燥的結(jié)痂。病變樣本必須儲存在干燥、無菌的試管中（無病毒運輸介質(zhì)）并保持低溫。猴痘的臨床診斷必須考慮其他皮疹疾病如：水痘、麻疹、細菌性皮膚感染、疥瘡、梅毒和藥物相關(guān)過敏。發(fā)病前期的淋巴結(jié)病可能是區(qū)分猴痘與水痘或天花的唯一臨床特征。

1.1 電鏡活檢

電鏡下MPXV呈胞漿內(nèi)磚狀，有側(cè)體，中心核約200-300 nm。由于OPV物種在形態(tài)上無法區(qū)分，該方法不能確定診斷，但可以提示該病毒屬于痘病毒科。

1.2 基因檢測

1.2.1 實時熒光定量PCR

對臨床、MPXV感染細胞培養(yǎng)物的MPXV DNA進行常規(guī)檢測，使用PCR或real-time PCR，建議在生物安全三級設(shè)施中進行。采用real-time PCR方法針對細胞外包膜蛋白基因（B6R）、DNA聚合酶基因、E9L的保守區(qū)，DNA依賴RNA聚合酶亞基18、rpo18和F3L基因進行檢測。

1.2.2 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）

PCR擴增基因或基因片段的限制性長度片段多態(tài)性（Restriction length fragment polymorphism, RFLP）也可用于MPXV DNA的檢測，但RFLP費時且需要病毒培養(yǎng)。PCR產(chǎn)物的RFLP也需要酶切后進行凝膠電泳，在快速、敏感和特異性至關(guān)重要的臨床環(huán)境中可能不是最佳的方法。

1.2.3 高通量測序技術(shù)（NGS）

采用NGS技術(shù)的全基因組測序仍然是區(qū)分MPXV和其他正痘病毒（OPV）表征的金標準，但該技術(shù)成本較高，測序數(shù)據(jù)的下游處理需要巨大的計算能力。因此，在撒哈拉以南非洲資源貧乏的國家NGS可能不是合適方法。

基因檢測技術(shù)中real-time PCR仍是MPXV常規(guī)診斷的首選方法，但必須輔以現(xiàn)場基因組測序技術(shù)，如Oxford Nanopore MinION，才能提供實時的病毒基因組數(shù)據(jù)，這對于循證流行病學(xué)干預(yù)是必不可少。

1.3 免疫檢測方法

猴痘病毒免疫檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IgG、IgM抗體和免疫組化檢測病毒抗原。用MPXV抗體進行免疫化學(xué)分析，可區(qū)分痘病毒感染和皰疹病毒。

已經(jīng)證實，抗病毒抗體和T細胞反應(yīng)在疾病發(fā)作前后增加，在皮疹發(fā)生后5天左右和8天以上的血清中分別檢測到猴痘病毒IgM和IgG。如果有皮疹和嚴重疾病史的未接種疫苗的個體血清中存在IgM和IgG抗體，則診斷可能存在MPXV感染。IgM捕獲ELISA陽性表明最近接觸過MPXV，而IgG捕獲ELISA陽性表明該個體以前通過接種疫苗或自然感染接觸過MPXV。在一個樣本中同時存在IgM和IgG，表明在以前接種過疫苗或接觸過自然感染MPXV的個體。然而，正痘病毒具有血清學(xué)交叉反應(yīng)性，抗原和抗體檢測方法不能提供猴痘特異性確認，但對于MPXV流行地區(qū)的血清學(xué)檢測也許是可行的方法。

參考文獻

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