化學(xué)發(fā)光標記技術(shù)及影響因素
化學(xué)發(fā)光標記技術(shù)按照標記反應(yīng)的過程和形成結(jié)合物的結(jié)構(gòu)特點，可分為直接偶聯(lián)和間接偶聯(lián)兩種方式。直接偶聯(lián)是指通過偶聯(lián)反應(yīng)使標記物分子中的反應(yīng)基團直接連接在被標記物分子的反應(yīng)基團上。間接偶聯(lián)的特點是在標記物與被標記物之間插入一條鏈或一個基團，使兩種物質(zhì)通過引進的“橋”連接成結(jié)合物。通過插入“橋”可以在原有的結(jié)構(gòu)中引進新的活性基團、增加反應(yīng)活性，還可以減弱參與偶聯(lián)雙方存在的空間阻礙效應(yīng)。小分子物質(zhì)結(jié)合物主要通過偶聯(lián)反應(yīng)制備；大分子物質(zhì)結(jié)合物主要交聯(lián)劑使標記物與被標記物結(jié)構(gòu)中的游離的氨基、羧基、咪唑基、酚基、羥基等形成不可逆連接。
常用的標記技術(shù)有以下幾種：
1.碳二亞胺縮合法
水溶性碳二亞胺成功的用于制備大分子-大分子或大分子-半抗原衍生物的交聯(lián)結(jié)合物。經(jīng)過碳二亞胺縮合反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中的游離羧基能與發(fā)光劑分子中的氨基形成較為穩(wěn)定的酞胺鍵。反應(yīng)條件比較溫和，應(yīng)用范圍廣。結(jié)構(gòu)中含有羧基或氨基的標記物均可選用此方法進行標記。可供使用的縮合劑有：二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亞胺-HCI（EDC）等。
2.重氮鹽偶聯(lián)法
此法也稱為“重氮化法”是在酸性和低溫條件下，用亞硝酸鹽將發(fā)光劑的伯氨基重氮化得到重氮鹽。再與蛋白質(zhì)作用生成發(fā)光劑-蛋白質(zhì)結(jié)合物。蛋白質(zhì)分子能偶合重氮鹽的位置有酪氨酸殘基上酚羥基鄰位，組氨酸殘基的咪唑環(huán)、色氨酸殘基的吲哚環(huán)等。
重氮化反應(yīng)用于標記發(fā)光劑具有簡便易行、成本低、重復(fù)性好等優(yōu)點。但因反應(yīng)是建立在NO2-與-NH2作用的原理上，若標記物結(jié)構(gòu)中無伯氨基則不易選用此方法。同時因脂肪族伯氨基與NO2-的反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定，易分解。所以，像ABEI、AHEI等伯氨基位于側(cè)鏈的發(fā)光劑也不能選用此法進行直接標記。這使重氮化法的應(yīng)用受到一定的限制。
3.混合酸酐法
結(jié)構(gòu)中含有羧基的分子（標記物或被標記物）在三乙胺或正三丁胺等的存在下與氯甲酸酯類反應(yīng)，生成活潑的混合酸酐中間體?；旌纤狒芘c另一分子的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵連接的共價化合物。目前采用的氯甲酸甲酯類有氯甲酸乙酯、氯甲酸異丁酯等。
4.N-羥基琥珀酰亞胺活化法
一些結(jié)構(gòu)中含有羧基的抗原，經(jīng)過N-羥基琥珀酰亞胺活化后再與發(fā)光劑的氨基偶聯(lián)成酰胺鍵。含有羧基的發(fā)光劑和催化劑（如血紅素類）也可以經(jīng)過活化用來與抗原的氨基偶聯(lián)。
5.過碘酸鹽氧化結(jié)合法
此方法也稱為“過碘酸鈉法”。先是利用過碘酸鹽氧化糖蛋白中糖基的鄰二羥基成為醛基，然后醛基與伯氨基反應(yīng)形成Schiff堿。Schiff堿經(jīng)NaBH4還原-N=C-鍵成為穩(wěn)定的結(jié)合物。
過碘酸鈉法也可用于酶免疫測定中制備酶標結(jié)合物。醛氨縮合成的Schiff堿經(jīng)NaBH4還原后的單鍵穩(wěn)定性好，標記物不易脫落。凡含有芳香伯胺或脂肪伯胺的標記物都可以選用此法。但因過碘酸鈉法的氧化反應(yīng)需有鄰二羥基存在，所以不適用于無糖基的蛋白質(zhì)。對于某些雖含有糖基，但氧化糖基后會影響免疫學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)，也不易選用過碘酸鈉法進行標記。
6.環(huán)內(nèi)酸酐法
通常用琥珀酸酐作為連接的“橋”，所以又稱為“琥珀酸酐法”。利用環(huán)內(nèi)酸酐與分子中的羥基或氨基反應(yīng)形成半酯或半酰胺。在經(jīng)過碳二亞胺法或混合酸酐法使其與另一分子中的氨基作用形成酰胺鍵。標記物與被標記物通過一個琥珀?；B接到一起。該方法的優(yōu)點是避免使用其他雙功能交聯(lián)劑時存在的副反應(yīng)。保證標記物和蛋白質(zhì)分子間的單向定量縮合，得到的結(jié)合物具有較高的標記率。
7.硫氰酸酯衍生物法
利用CSCI2先與標記物（或被標記物）的-NH2反應(yīng)形成硫氰酸酯衍生物，再與被標記物（標記物）偶聯(lián)成結(jié)合物。偶聯(lián)的位置主要是賴氨酸殘基的游離氨基上。標記反應(yīng)的條件溫和，獲得的結(jié)合物性質(zhì)穩(wěn)定，而且不損失活性。
8.O-（羧甲基）羥胺法
抗原結(jié)構(gòu)中的羰基（或經(jīng)過反應(yīng)形成的羰基）與O-（羧甲基）羥胺作用能縮合成O-羧甲基衍生物。O-羧甲基衍生物利用結(jié)構(gòu)中的羧基與標記物中的氨基結(jié)合成結(jié)合物。
-hydroxylamine.png "O-（羧甲基）羥胺法")
9.戊二醛法
戊二醛作為一個雙功能偶聯(lián)試劑可通過其兩個醛基分別與標記物及被標記物的伯氨基縮合，通過一個五碳橋偶聯(lián)成結(jié)合物。由于戊二醛在溶液中不僅以單體形式存在，而且出現(xiàn)大量的聚合體，故能在參與標記的雙方分子間構(gòu)成較大的距離，有利于減少在抗原抗體反應(yīng)時的空間阻礙。因此該方法作為標記酶的手段曾得到較多的研究。由于戊二醛法的偶聯(lián)不易定量控制并缺乏特異性，易引起同類物質(zhì)的自身聚合，所以在發(fā)光免疫測定標記中未受到廣泛重視。
影響標記的因素
1.發(fā)光劑的選擇：
發(fā)光免疫測定法應(yīng)根據(jù)實際需要和客觀條件的限制來選擇發(fā)光劑。由發(fā)光劑的結(jié)構(gòu)性質(zhì)選擇相應(yīng)的標記方法。在使用環(huán)酰肼類發(fā)光劑作為標記物時，應(yīng)優(yōu)先選用異魯米諾及其衍生物，尤其是帶有側(cè)鏈的衍生物（ABEI、AHEI等）。這不僅是由于參加偶合反應(yīng)的氨基位于支鏈端而減弱了偶合時空間位阻效應(yīng)，使之更易與蛋白質(zhì)等大分子連接。氨基的烷基化作用可增加芳環(huán)的量子效應(yīng)，減少發(fā)光效率的損失。吖啶酯類發(fā)光劑多選用N-羥基琥珀酰亞胺活化法進行標記。此類發(fā)光劑具有比魯米諾大的發(fā)光效率，在比較溫和的條件下僅有過氧化氫和稀堿便可激發(fā)化學(xué)發(fā)光。
2.被標記蛋白的性質(zhì)：
抗原作為被標記物時，應(yīng)具有較高的純度和免疫學(xué)穩(wěn)定性?？贵w作為被標對象則要求具有較高效價。同時需要提純IgG以代替全血清制備結(jié)合物，以減少血清中所含有的某些氧化酶類妨礙結(jié)合物的穩(wěn)定性，也可以排除某些發(fā)光物質(zhì)干擾發(fā)光免疫測定。
3.標記方法的選擇：
標記方法之間差異較大，不同方法都有獨特的反應(yīng)條件和適應(yīng)對象。熟悉這些方法的原理和應(yīng)用情況正確選擇與發(fā)光劑和被標記物結(jié)構(gòu)特點相適應(yīng)的偶聯(lián)方式是順利開展發(fā)光免疫測定法的必要條件。
4.原料比：
在制備發(fā)光劑-IgG結(jié)合物時，IgG：發(fā)光劑和交聯(lián)劑：IgG的分子濃度比（原料比）能影響結(jié)合物的發(fā)光效率。當確定一種交聯(lián)劑后，必須仔細地選擇它們之間的分子濃度比。選出最佳反應(yīng)的交聯(lián)劑：IgG：發(fā)光劑的反應(yīng)濃度。
5.標記率：
指結(jié)合物結(jié)構(gòu)中IgG結(jié)合發(fā)光劑的分子比。由于對應(yīng)于每一種發(fā)光劑或被標記物制備的結(jié)合物都有特定的最佳標記率。標記率選擇不好會造成發(fā)光效率低、不易保存和使用等現(xiàn)象。為確保結(jié)合物的發(fā)光效率和穩(wěn)定性，應(yīng)用中應(yīng)當根據(jù)發(fā)光劑和被標記物的性質(zhì)，通過實際實驗選擇出適用的標記率。
6.溫度：
對于比較穩(wěn)定的小分子來說被標記物的溫度控制不必太嚴。而當被標記物是抗原或抗體蛋白質(zhì)時，由于蛋白質(zhì)對熱的不穩(wěn)定性，應(yīng)當在保證反應(yīng)進行前提下盡量選擇低溫條件，以免在標記過程中造成蛋白質(zhì)分解、變性和喪失活性。
7.純化與保存：
多數(shù)經(jīng)偶合反應(yīng)制備的結(jié)合物使用前都需進行純化。其主要目的是除去反應(yīng)系統(tǒng)中存在的未結(jié)合發(fā)光劑和交聯(lián)劑。一般可利用透析法、凝膠過濾法和鹽析沉淀法等進行純化。提純的結(jié)合物應(yīng)及時測定蛋白質(zhì)的含量、免疫學(xué)活性和發(fā)光效率等指標。由于標記過程的不規(guī)范或存放過程中可能出現(xiàn)的脫落現(xiàn)象，對于新制備的或經(jīng)較長時間保存的結(jié)合物在使用前都要測定這三項指標，以保證實驗結(jié)果準確、可靠。結(jié)合物一般可分裝保存在4-70℃條件下。最好能經(jīng)過冰凍干燥保存，這可保存數(shù)年之久不喪失活性。
參考文獻
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