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新冠中和抗體原理及檢測

談“毒”色變是人類對于病毒一直以來的態(tài)度,從埃博拉到SARS,再到如今的2019新型冠狀病毒(SARS-CoV-2),無不對人類健康產(chǎn)生了巨大威脅。了解病毒的入侵機制對于研究相應治療方案必不可少。SARS-CoV-2病毒中有個重要的棘突S蛋白(spike protein),S蛋白是一類由S1/S2異二聚體組成的三聚體跨膜糖蛋白,可識別宿主細胞受體-血管緊張素轉換酶2(ACE2)并介導膜融合,其含有的一個C端受體結合域(RBD)更是直接參與了宿主受體的識別,介導病毒入侵宿主細胞。

中和抗體

免疫系統(tǒng)在經(jīng)受病毒刺激后會產(chǎn)生相應的抗體,有些抗體可以和病毒顆粒結合,阻止病毒感染細胞,以此把病毒“中和”掉了,這些抗體就稱為“中和抗體”。也就是說,中和抗體實際上是普通抗體的一種。我們正常所說的抗體是指病毒入侵后機體產(chǎn)生的抗體的統(tǒng)稱,它包含針對不同病毒識別表位產(chǎn)生的多個抗體,大部分抗體是通過向T-淋巴細胞發(fā)出鎖定抗原的信號,激發(fā)細胞免疫反應,殺死病毒,而中和抗體則是特異針對病毒中和表位產(chǎn)生的抗體,可直接靶定到病毒中和表位,使病毒失去結合受體的能力,這一過程不需要激活T-淋巴系統(tǒng)。同時研究發(fā)現(xiàn)不同結合表位的中和抗體活性也存在差異,其中與病毒中和表位完全吻合的中和抗體活性最好,與病毒中和表位有差異但存在一定覆蓋的中和抗體活性顯著降低。

在新冠疫情大肆蔓延的背景下,國家科學技術部發(fā)布了《新型冠狀病毒中和抗體產(chǎn)品研發(fā)應急項目申報指南》,申報指南指出中和抗體具備阻斷病毒侵染目的細胞的潛力,且單克隆抗體具有作用機制明確、易于大規(guī)模產(chǎn)生的優(yōu)點,是新冠病毒治療藥物研究的重點方向??茖W家們紛紛將目光投向了新型療法---中和抗體療法。近期由清華大學和深圳國家感染性疾病臨床醫(yī)學研究中心合作,成功從新冠感染者外周血單核細胞中分離出了表達抗體的B細胞,并在人體外實現(xiàn)了抗體表達,獲得了2株中和功能較好的單克隆抗體。這種單克隆抗體抗體便是能特異性結合RBD蛋白,并有效阻斷病毒與宿主細胞受體ACE2蛋白結合的新冠中和抗體。

2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)中和抗體的檢測方法

新冠中和抗體的檢測可以反映群體的感染率、個人的康復情況以及疫苗的效果,但傳統(tǒng)的病毒中和實驗需使用活病毒和細胞,且對實驗室安全性及操作人員技能要求較高。這種耗時長、要求高的傳統(tǒng)中和檢測方法顯示不適用于傳播速度快、感染覆蓋范圍廣的新冠疫情。因此,衍生出了幾種無需使用感染性病毒、快速檢測新冠中和抗體的方法。

一、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測

該方法利用新冠病毒蛋白結合結構域RBD抗原和受體蛋白ACE2抗原之間的結合,模擬病毒與宿主細胞的相互作用,通過顯色反映判斷病毒感染情況,但當中和抗體存在時,便會阻斷蛋白互作,顯色反應減弱。

Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

二、膠體金試紙條

膠體金平臺利用競爭法檢測中和抗體,RBD抗原用膠體金標記并固定在結合墊上,ACE2抗原固定在NC膜的T線上,能與膠體金標記RBD抗原特異結合的抗體固定于NC膜的C線上。當待測樣品中有新冠中和抗體時,中和抗體會和RBD抗原結合,降低了RBD和ACE2的結合效率,T線顯色度顯著下降。

Colloidal gold test strip

三、hiVNT系統(tǒng)

“hiVNT系統(tǒng)”依賴于一個人為改造的生物發(fā)光報告基因NanoLuc熒光素酶,NanoLuc可切分成兩個亞基,分別是11aa的小亞基HiBiT和156aa的大亞基LgBiT,兩個亞基分開時不具有發(fā)光活性,但是融合后又能恢復熒光素酶的活性。 “hiVNT系統(tǒng)”檢測新冠中和抗體就是通過組合表達S蛋白和帶HiBiT標簽的病毒樣顆粒VLP,當S蛋白與VeroE6/TMPRSS2細胞表面ACE2受體結合后,VLP膜與宿主細胞膜融合,衣殼蛋白被吸收到細胞中后,HiBiT與宿主細胞中穩(wěn)定表達的LgBiT蛋白相互作用形成NanoLuc熒光素酶,如果同時添加含中和抗體的血清(如新冠康復期患者的血清),NanoLuc熒光素酶的發(fā)光強度顯著下降,該檢測方法可以作為評價新冠治療效果的依據(jù)。

hiVNT

目前這幾種新冠中和抗體檢測方法都兼具快速、高通量的特征,可針對性地檢測干預治療后新冠患者體內的中和抗體數(shù)量,作為疫苗有效性的檢測標準,為后期新冠疫苗大規(guī)模篩選提供最合適、最快速的檢測方法學。

參考文獻

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